杨林花教授：成人及儿童ITP领域重磅研究，照亮精准化治疗之路

编者按：免疫性血小板减少症（ITP）是自身免疫性疾病，引起ITP的原因目前尚不清楚。鉴于ITP临床的异质性，精准化和个体化研究越来越受到重视。在12月7日至10日召开的2024年美国血液学会（ASH）年会上，部分关于成人或儿童ITP疾病差异性的研究结果公布。《肿瘤瞭望-血液时讯》特邀山西医科大学第二医院杨林花教授，精选其中两项重磅研究进行精彩点评，期待为大家带来启发。

01

T细胞转录组特征在不同年龄组的成人未治疗原发免疫性血小板减少症中的差异，揭示不同药物干预策略

T-Cell Transcriptomic Signatures in Adults with Primary Untreated Immune Thrombocytopenia Segregate By Age, Revealing Distinct Druggable Pathways（摘要号：124）

背景

免疫性血小板减少症（ITP）是先天性免疫缺陷（IEI）中一种常见自身免疫性疾病。作为单基因疾病，一些IEI目前可以使用突变特异的药物治疗，这些药物也能治疗共存的ITP。在成人中，约80%的ITP被认为是“原发性”或“特发性”，其特征是表型、治疗选择和治疗反应的显著异质性。我们中心一项最新的研究表明，在慢性难治性ITP的成人患者（年龄≥18岁）中，发现了高频率的杂合型IEI相关致病基因变异，尽管没有病例被确诊IEI。我们假设，“原发性”ITP成人患者的基因组、转录组和细胞因子特征存在差异，这为细化ITP诊断分类和优化治疗方案提供了可能。

方法

在获得IRB（机构审查委员会）批准后，我们招募了年龄≥18岁的原发性ITP患者（血小板计数≤100×103/μL），患者没有接受积极的治疗，并且招募了年龄/性别匹配的健康对照组。进行了针对IEI的靶向基因测序、外周血单核细胞转录组学检测使用nCounter T细胞（780种基因）和自身免疫（770种基因）套餐（NanoString Technologies），实施了单细胞RNA测序（CITE-seq）和细胞因子检测（Bio-rad公司）。

结果

在2023年9月至2024年7月期间，招募了23名成年患者和23名健康对照者。在3名男性和20名女性中，有3例因在样本采集时可能存在先天性巨大血小板症、幽门螺杆菌感染和免疫抑制被排除。样本采集时的平均年龄为46岁，而诊断ITP时的平均年龄为36岁。55%的患者为白人，80%的患者为慢性ITP，20%的患者有自身免疫性疾病家族史，10%的患者曾接受过脾切除术。样本采集时的平均血小板计数为47×103/µL，平均未成熟血小板比例为18%。55%的患者出现T细胞、B细胞和NK细胞亚群异常。所有病例的免疫球蛋白定量均正常。

对转录组数据进行非监督等级聚类分析发现，年轻成年ITP患者（18-40岁）形成了一个独特的聚类，而年长（年龄≥40岁）患者和82%的对照组则分别聚类（P≤0.0001）。按疾病发病年龄分析时，这些聚类也类似地分为两个不同组（P=0.009），这在T细胞转录组中尤为明显。各聚类之间在其他人口统计学特征或细胞特征（如样本采集时的血小板计数）方面未发现显著差异。通路分析显示，年轻患者中mTOR、NF-κB和MAPK-Pi3K相对过表达，而年长患者中自噬和JAK-STAT信号传导增加。对不同年龄亚组患者的单细胞RNA测序发现，某些T细胞亚群存在差异；年长患者中效应记忆T细胞更多，而年轻患者中CD4-CD8-（双）阴性T细胞比例更高。细胞因子研究表明，与年轻ITP患者相比，年长ITP患者的CCL-2水平更高（P

IEI基因组检测发现，每位患者平均有3.5（标准差1.2）个基因变异。所有患者至少携带1个变异。1名在使用艾曲泊帕后血小板增加相对较少的患者，在LRBA基因中有2个变异（家系测试待确定方向）。不同年龄段患者之间未发现显著差异。目前正在进行免疫表型分析和功能研究。

讨论

在这项采用综合多组学方法分析成人未治疗的原发ITP患者特征的前瞻性对照研究中，我们发现了T细胞转录组通路中存在年龄特异性差异。这些数据进一步证实了先前已知的T细胞在ITP发病机制中的作用。鉴于有研究表明西罗莫司（一种mTOR抑制剂）在这类年轻成人ITP患者中有效，因此这些患者中mTOR表达增加的现象引人关注。同样，PI3K抑制剂和共刺激阻断剂已在某些IEI中使用，可能对抗在年轻ITP患者中显著过表达的这一通路。JAK抑制剂成功治疗难治性ITP患者，可能的解释是该通路在年长ITP患者中过表达。虽然基因组分析提示该队列中可能存在免疫调节异常的变异，但还需要更多工作来确定早期组学检测在临床实践中的作用。

结论

在患有“原发性”ITP的成年患者中，与年龄相关的T细胞转录组聚类是一项新发现，值得进一步研究，以开发个性化治疗和精准医疗。

杨林花教授点评

在2024年度ASH会议上，一篇关于“T细胞转录组特征在不同年龄组的成人未经治疗的原发免疫性血小板减少症中的差异”的口头发言，引起了广泛关注。该研究通过综合多组学方法，分析了未经治疗的原发ITP成年患者的T细胞转录组特征，通过靶向基因测序、单核细胞转录组学检测，发现了T细胞转录组通路中存在年龄特异性差异，揭示了显著的年龄相关差异。基因组学与转录组学的结合分析，为深入理解ITP发病机制和优化治疗策略提供了宝贵线索。例如年轻患者中mTOR和PI3K通路的过表达提示，mTOR抑制剂如西罗莫司或PI3K抑制剂可能具有治疗潜力。而在年长患者中，JAK抑制剂可能更为适用。尽管本研究仍需更多的功能验证和大规模验证，但其提出的年龄相关免疫学差异理论，为未来开发精准医疗奠定了基础。随着研究的深入，临床医生有望根据患者的年龄和分子特征，选择最优的治疗方案，从而显著改善患者预后。这不仅为ITP的精准医疗奠定了基础，也为其他自身免疫性疾病的研究提供了新方法。

02

儿童免疫性血小板减少症的T细胞克隆性表达

T Cell Clonality in Paediatric Immune Thrombocytopenia（摘要号：550）

引言

免疫性血小板减少症（Immune thrombocytopenia，ITP）是一种复杂的自身免疫性疾病，其特征是持续的低血小板计数。引起ITP的原因目前尚不清楚，鉴于临床的异质性，可能涉及每一位患者不同的致病机制。尽管有新的治疗方法，一些患者对任何治疗都没有反应，而且常常有严重的症状。了解为什么一些患者从新诊断的ITP发展为慢性病，以及为什么一些患者发展为难治性疾病将有助于我们更好地指导这些患者的治疗。

我们之前已经描述了在新诊断ITP儿童和慢性ITP儿童中不同TCRVβ家族的情况。在这个扩展的儿童队列中，我们利用 T 细胞受体(T-cell receptor，TCR)基因的二代测序，结合单细胞RNA和TCR测序来鉴定疾病状态之间的差异并探索潜在的疾病预后预测因子。

方法

50名原发性ITP 患儿和10名健康对照(healthy controls，HC)来自帝国理工学院国家卫生服务信托基金和Lucile Packard儿童医院(斯坦福大学儿童医院)。使用内部方法对 TCR β 基因进行二代测序，并在Illumina MiSeq 平台上进行测序。使用MiXCR对原始TCR序列进行分析。使用10x基因组学平台(Chromium Single Cell VDJ 和5′Library 试剂盒)对两名难治性患者进行单细胞和RNA联合测序。使用Cell Ranger进行样品测序文库拆分、条形码处理和单细胞5′端分子标签计数。使用Seurat进行基因表达分析。

根据患者取样时ITP疾病的分期定义患者：新诊断ITP(诊断后3个月内，n=24)；慢性ITP(>12个月，n=25)；如果患者对包括血小板生成素受体激动剂(thrombopoietin receptor agonists，TPO-RA)、霉酚酸酯和利妥昔单抗在内的3种既往治疗无反应，则是难治性ITP(n=5)。

结果

与慢性ITP患儿相比，新诊断ITP患儿的TCR 库和扩增的T细胞克隆更为有限。在确诊后三个月内，如果患者的扩增 T 细胞克隆占比超过1%，他们较少可能进入长期缓解状态（P=0.03）。我们还发现某些TCRV β基因在发生难治性疾病的患者中优先表达。一名随访多年的患者，T 细胞克隆持续多年，并与血小板计数相关。

聚类分析的scRNA测序数据显示15个不同的群和亚群的免疫细胞。与HC相比，难治性ITP患儿CD14、CD16单核细胞和记忆B细胞比例较高，CD8 TCM亚群比例较低。慢性难治性ITP患者有高表达GZMA,NKG7,GZMB和KLRD1基因的CD8 TEM亚群。

ScTCR-seq 显示，难治性ITP患儿有克隆扩增的T细胞，前10个扩增克隆占TCR库空间的25-50% 。我们发现克隆扩增的 T 细胞全部由 CD8 TEM 亚群组成。扩增的克隆表达包括GNLY，NKG7，GZMB和GZMA以及干扰素基因(IFITM3和ISG15) 在内的细胞毒性基因，无耗竭证据（没有表达CTLA4，HAVCR2和TIGIT)。

结论

使用二代测序研究儿童ITP患者的TCR库，首次证明扩增的T细胞克隆在诊断的前三个月内存在，并可以预测患者是否会进入长期反应。T细胞克隆持续时间长，与血小板计数相关。某些V-J基因家族在难治性疾病的儿童中更常见，使用单细胞基因表达谱结合TCR测序，我们发现扩展的克隆在难治性疾病患者中富集，并表现出细胞毒性表型。我们的研究结果为T细胞介导的疾病在难治性ITP儿童中的作用提供了关键的见解。

杨林花教授点评

免疫性血小板减少症（ITP）是自身免疫性疾病，引起ITP的原因目前尚不清楚。鉴于ITP临床的异质性，个体化研究也越来越受到重视。在今年2024 ASH口头报告中，有关“血小板数量及功能异常疾病：临床与流行病学：大数据与基础医学”分会场，由来自帝国理工学院国家卫生服务信托基金和 Lucile Packard 儿童医院研究团队对50名原发性 ITP 患儿和10名健康对照儿童，作者采用TCR β基因二代测序、单细胞和RNA联合测序，鉴定儿童ITP疾病状态之间的差异，就是一个很好的例子。对于疾病的转化研究，结合临床、大数据、基础研究、流行病学及分子生物学的联系越来越紧密。该研究提供了理解儿童难治性ITP发病机制的独特视角，同时对未来ITP的个体化治疗提供了新的研究基础。

杨林花 教授

山西医科大学第二医院

山西医科大学血液病研究中心主任，山西医科大学第二医院血液科

二级教授、博士生导师，国务院特殊津贴专家

中华医学会血液学会常委

中国血液病专科联盟副理事长

中国医药教育协会血液专业委员会副主任委员

中国康复医学会血液病康复专业委员会副主任委员

中国研究型医院协会血液病精准诊疗专业委员会副主任委员

CSCO白血病淋巴瘤专家委员会常委

海峡两岸医药卫生交流协会血液病专委会常委

中国病理生理学会血液免疫分会常委

中国女医师协会血液肿瘤专业委员会常委

山西省医师协会血液医师分会会长

山西省抗癌协会白血病淋巴瘤专业委员会主任委员

《Hemophilia》《Blood》中文版编委，《中华血液学杂志》《中华内科杂志》《中华全科医师杂志》《中华细胞与干细胞杂志》等编委