默克生命科学 | 膜层析法在肺炎多糖疫苗纯化工艺中的应用

由肺炎链球菌引起的肺炎严重危害5岁以下儿童和65岁以上老人的生命健康。根据WHO公开的数据，2017年5岁以下死于肺炎的儿童超过80万，占据5岁以下儿童死亡率的15%。接种肺炎多糖疫苗是预防肺炎感染的有效方式。实验流程详情可以去默克的官网搜索查看www.sigmaaldrich.cn。#默克生命科学#

传统的肺炎多糖疫苗纯化方法（包括乙醇沉淀，苯酚抽提等）一般会使用大量的有机溶剂，不仅对环境和操作人员的健康造成危害，而且还需要额外的工艺来去除有机溶剂以保证产品的安全性，使整体工艺变的更为繁琐，降低收率。因此，肺炎多糖疫苗的生产需要开发环境更友好，纯化效率更高的纯化工艺。

近年来，离子交换层析由于具有高分辨率，环境友好且流穿模式易于放大等优点，成为新一代肺炎多糖疫苗工艺的新选项。但由于多糖尺寸很大，传统柱层析的上样载量和流速都受到一定限制。目前膜层析技术作为新型的纯化技术，可以克服传统柱层析载量和流速受限问题。膜层析具有的三维立体结构提供了更大的比表面积，不仅可以实现高密度的配基提升结合载量，而且可使内部孔隙相互连接，最终实现对流传质，提高流速（图1）。

图1. 具有3D结构的NatriFlo® HD Q 膜层析

本文将分享我们使用默克的NatriFlo® HD Q阴离子膜层析纯化5型肺炎球菌荚膜多糖的案例。在这个案例中，我们首先使用0.2ml规模的膜层析设计DOE实验，以杂质DNA去除效果和产品收率为响应，优化纯化工艺参数。然后使用优化的参数，在放大系统上进行放大的确认，为这一步在生产上的应用提供了参考。

在本案例中，我们以5型肺炎球菌荚膜粗多糖样品为初始料液，料液中主要杂质为约40%固含量的DNA，通过检测流穿液中的氨基己糖含量和DNA含量来评估多糖回收率和DNA杂质去除能力。

小试工艺优化试验

首先基于多糖的等电点以及NatriFlo® HD Q的特点，选择上样pH，上样NaCl浓度，上样流速，上样多糖浓度以及上样载量共5个因子进行分辨率为IV的部分析因试验，响应值为多糖回收率以及DNA含量。

表1 部分析因设计因子水平

通过方差分析以及残差分析，发现回收率和DNA含量两个响应值的模型在统计学上都显著有效。两个模型都存在弯曲，需通过进一步的响应面试验完善模型。根据试验结果，对于DNA含量，除了流速外，其他四个因子（pH，NaCl浓度，样品浓度和上样载量）均对DNA的去除效果有显著影响，且因子之间存在交互作用。对于回收率，只有上样NaCl浓度，上样浓度以及上样载量三个因子对回收率有显著影响，因子之间存在交互作用。

为了满足工艺回收率>80%的需求以及药典对肺炎多糖中DNA含量

响应面试验结果表明，在测试参数范围内，回收率均大于80%，流穿液中的DNA含量均小于2%，这表明NatriFlo® HD Q膜层析用于纯化肺炎多糖在保证高回收率的同时也可以满足质量要求，工艺稳健。响应面方差分析结果表明，上样载量是唯一显著影响DNA去除的因子，且随着上样载量的增加，流穿液中的DNA含量逐渐增加。对于回收率，选择的三个因子在测试范围内对回收率都没有显著影响，这与部分析因试验中的回收率预测结果一致（载量300mmol/L，回收率>80%）。

工艺放大和重复

放大确认试验利用15ml的NatriFlo® HD Q膜对两批料液进行纯化，以确认纯化工艺在杂质去除和收率上的可放大性。结果表明利用小试DOE实验确定的参数进行放大，可以满足DNA80%的目标，与DOE试验中的预测结果一致，进一步证明了NatriFlo® HD Q层析应用在该步纯化工艺上的可放大性和稳健性。

表2 NatriFlo® HD Q 放大确认试验结果

总结

本文我们将新型的膜层析技术应用于肺炎多糖疫苗的纯化上，考察粗多糖料液中DNA的去除效果和多糖回收率。在满足工艺回收率>80%的需求以及DNA含量